Protocole (version courte en PDF)

 

 

 

 

 

 

Lausanne, le 27 février 2014

La transformation des bactéries avec un plasmide est utile si nous voulons exprimer un gène dans une souche de bactéries, par exemple un gène codant pour une protéine. Dans mon travail au Laboratoire de biologie structurale et biophysique à l’EPFL, je suis souvent amené à transformer des bactéries avec un plasmide. Aujourd’hui par exemple, j’aimerais transformer 4 plasmides contenant chacun le gène de la protéine X avec une mutation différente. J’aimerais transformer ces plasmides dans la souche E. coli B834(De3) parce que cette dernière se prête particulièrement bien à l’expression de protéines. J’utilise les bactéries en quelque sorte comme des petites usines pour produire ma protéine d’intérêt. D’autres souches de E. coli se prêtent mieux à d’autres fins, e.g. la souche DH5α se prête bien à la production de plasmide afin de l’extraire par préparation de plasmide (miniprep, midiprep ou maxiprep) pour augmenter notre stock de plasmide.

Aujourd’hui, je procèderai à une transformation chimique des bactéries. Il existe aussi la transformation électrique (par électroporation) des bactéries, discutée dans un autre post.

Marche à suivre

1. Sortir les bactéries compétentes B834(De3) du congélateur à – 80 °C et les faire dégeler sur de la glace. Faire de même avec les plasmides stockés à – 20 °C.

2. Pour chaque transformation, transférer 50 µl de bactéries compétentes dans un tube eppendorf de 1,5 ml.

3. Ajouter 2 µl de plasmide à une concentration de 15 ng/µl. La quantité finale de plasmide doit se situer entre 10 ng et 100 ng. Dans le cas présent, la mass finale de plasmide est de 30 ng.

4. Incuber le mélange de plasmide et de bactéries compétentes pendant 30 minutes sur la glace.

5. Pendant les 30 minutes d’incubation, nous allons préparer des boîtes d’agar contenant de l’antibiotique (ici de l’ampicilline). Si les boîtes sont déjà prêtes, les sortir du frigo et les mettre dans le thermostat à 37°C. Dans le cas contraire, nous allons préparer des boîtes d’agar fraîches. D’abord, faire fondre l’agar au micro-ondes. Perso, je fais fondre graduellement, i.e. pendant 2 minutes séparées d’un coup d’oeil pour monitorer l’avancement de la fusion et l’état du micro-ondes. Attention à que le bouchon ne soit pas fortement fermé (tight). Le bouchon doit pouvoir danser sur la bouteille, i.e. être lâche (loose), afin que l’air puisse sortir de la bouteille pendant l’augmentation de température (rappel de la loi des gaz parfaits: PV = nRT -> si la température augmente et que la bouteille est fermée (V constant), la pression dans la bouteille augmente et celle-ci risque d’exploser!).  Après fusion de l’agar, en verser une quantité suffisante dans des tubes falcon de 50 ml (environ 20 ml par boîte de Pétri). Attendre que la température baisse suffisamment avant d’ajouter l’antibiotique. En effet, si l’antibiotique est ajouté trop tôt, la température élevée risque de le détruire. D’un autre côté, si nous attendons trop avant d’ajouter l’antibiotique, l’agar risque de se solidifier. Les étapes suivantes se passent près d’une flamme au bec Bunsen afin de ne pas contaminer l’agar avec des bactéries de l’air. Aujourd’hui, je prépare 5 boîtes d’agar avec antibiotique et je verse donc 100 ml d’agar dans 2 tubes falcons de 50 ml. Après que la température soit descendue suffisamment (un bon indice est qu’en touchant le tube avec l’avant bras, la sensation ne doit pas être douloureuse), j’ajoute 50 µl d’antibiotique 1000 x dans chaque tube. Je verse ensuite l’agar liquide dans les boîtes autour de la flamme et je les laisse ouvertes afin qu’elles sèchent.

6. Après les 30 minutes d’incubation sur glace, nous passons au choc thermique: chauffer les bactéries pendant 5 minutes à 42 °C sur un bloc chauffant.

7. Remettre les tubes sur glace pendant 2 minutes.

8. Ajouter 1 ml de milieu LB dans le tube eppendorf de 1,5 ml et transférer le tout (1,057 ml) dans des tubes de culture de 12 ml à incuber pendant 30-60 min à 37 °C à 220 rpm. Cette période de temps permet aux bactéries d’exprimer la résistance à l’antibiotique codée sur le plasmide.

9. Etaler 50 µl sur les boîtes d’agar contenant l’antibiotique. Seules les bactéries ayant incorporé l’antibiotique formeront des colonies pendant la nuit.

10. Incuber du jour au lendemain à 37°C dans le thermostat.

Lausanne, le 28 février 2014

9. Vérifier la présence de colonies dans les boîtes sur lesquelles des bactéries transformées ont été étalées. Vérifier que le contrôle négatif, la boîte sur laquelle des bactéries non transformées ont été étalées, ne contienne pas de colonies.

ingrédients

– des bactéries “compétentes”, i.e. facilement transformables par de l’ADN exogène. Les bactéries doivent soit être sensibles à un antibiotique, soit être auxotrophes.

– de l’agar en poudre

– un plasmide portant un gène de sélection. e.g. un gène produisant de la beta-lactamase donnant la résistance à l’antibiotique ampicilline ou un gène dont le produit permet la synthèse d’un nutriment rendant les bactéries qui l’expriment prototrophes.

– en fonction du gène de sélection: antibiotique ou milieu sélectif pour bactéries prototrophes.