Lausanne, le 28 février 2014

Souvent, lorsqu’on travaille avec une nouvelle construction plasmidique (construct), nous voulons vérifier que les bactéries qui ont incorporé le plasmide produisent bel et bien la protéine dont le gène se trouve sur le plasmide. Pour cela, il est conseillé d’effectuer un test d’expression de protéine à petite échelle avant de passer à une échelle plus grande, nécessaire à la production d’une quantité importante de protéine. Dans le cas où la protéine n’est pas exprimée, cela peut indiquer un problème avec le plasmide ou bien que la protéine est dégradée (en particulier dans le cas d’une expression dans des cellules eucaryotes, où le protéasome dégrade les protéines mal pliées) et il faut résoudre ce problème avant de passer à une expression à grande échelle.

Point de départ de l’expérience: colonies sur boîte d’agar.

Point d’arrivée: gels de polyacrylamide produits par SDS-PAGE et indiquant le degré d’expression de la protéine.

Marche à suivre

1. Choisir une ou plusieurs colonies en essayant d’éviter les colonies satellites (cf. lexique pour définition).  Choisir plusieurs colonies augmente les chances d’obtenir au moins un résultat positif. Les étapes suivantes sont décrites pour une colonie.

2. Inoculer 4 tubes de culture de 12 ml contenant 2 ml de milieu de culture LB + antibiotique à partir d’une seule colonie. En outre, il est conseillé d’avoir un contrôle négatif et un contrôle positif pour l’expression. Pour le contrôle positif, utiliser un stock de glycérol dont on sait qu’il exprime une protéine (n’importe laquelle) et pour le contrôle négatif utiliser des bactéries non transformées. Enfin, utiliser un tube supplémentaire inoculé avec n’importe quelle colonie. Ce tube servira à mesur la densité optique (DO) à 600 nm.

3. Incuber avec rotation à 37°C pendant quelques heures jusqu’à ce que la densité optique à 600 nm du tube supplémentaire atteigne au moins 0.6. A ce moment-là, les 4 tubes inoculés avec la même colonie prennent des chemins différents:

a. Un tube, marqué iNI37, reste à 37°C sans aucun traitment. i va de 1 au nombre de colonies sélectionnées.

b. Un autre tube, marqué iI37, est induit à l’IPTG (1 mM de concentration finale) et reste à 37°C.

c. Un troisième tube, marqué iNI18, est déplacé à 18°C.

d. Le dernier tube, enfin, marqué iI18, est induit avec de l’IPTG et déplacé à 18°C. C’est ce dernier tube qui donne normalement l’expression maximale, en raison de l’induction et du déplacement à 18°C. A cette dernière température, les bactéries cessent de se multiplier et peuvent focaliser leur énergie sur la production de la protéine d’intérêt.

4. Laisser incuber au moins 3,5 heures aux températures respectives. Si c’est très tard et que vous voulez rentrer à la maison absolument, vous pouvez aussi laisser incuber du jour au lendemain.

5. Après l’incubation, transférer 1 ml de culture dans un tube eppendorf de 1,5 ml.

6. Centrifuger 10 min à 15’000 rpm.

7. Jeter le surnageant.

8. Resolubiliser le culot dans 200 µl de BugBuster. Cette solution va lyser les cellules.

9. Centrifuger 10 min à 15’000 rpm.

10. Transférer le surnageant (la partie soluble) dans un autre eppendorf de 1,5 ml.

11. Aliquoter 30 µl de partie soluble dans un autre tube eppendorf contenant 30 µl de solution Lämmli 2x (solution de chargement pour le SDS-PAGE).

12. Resuspendre le culot (la partie insoluble) dans 50 µl de solution Lämmli 2x.

13. Chauffer les tubes contenant le Lämmli à 95°C pendant 5 min et charger dans des gels de polyacrylamide.

Il est aussi possible d’utiliser des erlenmeyer au lieu des tubes de culture.

 

Lexique

Colonie satellite: colonie de bactéries non transformées qui réussit à pousser sur de l’agar contenant de l’antibiotique en raison de la dégradation de l’antibiotique par une colonie voisine qui exprime la résistance à l’antibiotique et dégrade l’antibiotique qui l’entoure.